Les Plasmides/vecteurs les plus utilisés

Un vecteur est une molécule d’ADN utilisée pour transférer un gène d’intérêt d’un organisme à un autre. Un gène est une unité de base de caractères héréditaires contenant un matériel génétique, i.e. ADN. Un gène d’intérêt peut être intégré dans le matériel génétique du vecteur qui l’introduit ensuite dans un autre organisme. Deux vecteurs sont couramment utilisés. Ce sont les plasmides et les vecteurs viraux.
Les plasmides sont les vecteurs les plus couramment utilisés dans le cadre de la transformation végétale. Ils sont utilisés pour copier le gène d’intérêt et pour transférer les gènes étrangers dans l’organisme hôte. Les plasmides sont de petits morceaux circulaires d’ADN rencontrés dans la plupart des bactéries et certains champignons, protozoaires, plantes et animaux. Les plasmides sont séparés des chromosomes. Les chromosomes sont les structures de base contenant l’ADN dans les cellules (Figure 1). Les plasmides se multiplient indépendamment des chromosomes..

Figure 1:Cellule d’une bactérie montrant le chromosome et l’ADN du plasmide

Source: www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/mol_gen.htm

Les plasmides utilisés pour la transformation végétale contiennent trois éléments clés :

  • Une origine de la duplication : Il s’agit d’une séquence d’ADN dans le plasmide qui indique là où la duplication devrait commencer. La duplication de l’ADN est un processus par lequel de nouvelles copies d’ADN sont produites permettant de transmettre le plasmide à la nouvelle génération lors de la division cellulaire. La plupart des plasmides utilisés comme vecteurs de clonage peuvent se dupliquer en un grand nombre dans les cellules hôtes produisant ainsi plusieurs copies du gène d’intérêt. D’autres plasmides ont des origines de duplication qui leur permettent de se dupliquer en différents types de bactérie (e.g. Escherichia coli et Agrobacterium tumefaciens.
  • Un gène sélectionnable : Ce gène est requis pour faire la différence entre les cellules contenant le plasmide avec le gène d’intérêt et celles qui confèrent la résistance aux antibiotiques et aux herbicides. Les marqueurs sélectionnables les plus couramment utilisés pour la transformation des plantes incluent le gène conférant une résistance à la kanamycine néomycine phosphotransférase II (NPTII), servant à la sélection dans une culture contenant de la kanamycine, le gène du phosphinothricine acetyltransférase (HPH), servant à la sélection dans une culture contenant de l’hygromycine B. Les cellules n’ayant pas de gènes marqueurs sélectionnables ne peuvent pas croitre en présence de l’antibiotique ou de l’herbicide ciblée par le gène introduit ; seules les cellules ayant le plasmide avec le gène marqueur peuvent se régénérer.
  • Un site de clonage : c’est un emplacement dans le plasmide où un bout d’ADN (avec un gène cible) est inséré.

Un exemple de plasmide Ti couramment utilisé est le pBIN19 (Lee and Gelvin, 2008). Le pBIN19 a deux gènes conférant une résistance aux antibiotiques, l’un sur le plasmide avec un promoteur bactérien pour permettre une sélection des bactéries ayant le plasmide. Le second est localisé dans la région de l’ADN-T contrôlée par un promoteur végétal pour permettre la sélection des cellules modifiées de la plante. Il comporte également les origines de réplication de l’Escherichia coli and A. tumefaciens. Le pBIN19 est un exemple de vecteur navette (i.e. il peut se propager dans deux différentes espèces hôtes). Le pBIN19 peut être manipulé en E. coli pour produire rapidement plusieurs copies du gène d’intérêt et pour entreprendre les étapes d’assemblage nécessaires afin de rassembler le transgène (gène désiré, promoteur, marqueur sélectionnable et les frontières de l’ADN-T dans les positions normales). Il pourrait ensuite être transféré à l’A. tumefaciens, qui est plus difficile à manipuler, pour être utilisé lors de la transformation végétale.

L’Agrobacterium tumefaciens est naturellement capable de transférer de l’ADN dans le chromosome d’une plante hôte. Cette bactérie contient souvent un plasmide appelé plasmide Ti qui un ADN large, circulaire et à double brins qui peut se répliquer indépendamment du génome de l’A. tumefaciens. Lorsque la plante hôte est infectée, une portion du plasmide Ti appelé ADN-T (ADN transféré) comprenant le gène cible se détache et est transféré dans le chromosome hôte. Une fois dans les cellules de la plante, l’ADN-T s’incorpore au chromosome entrainant la modification génétique des cellules. Les cellules des plantes GM contenant le gène d’intérêt se régénèrent pour devenir des plantes entières qui passeront ce gène aux générations futures de la plante grâce au processus naturel de transmission génétique.
Les vecteurs viraux peuvent être également utilisés pour transférer les cellules végétales pour des fins spéciales. Pour plus d’informations relatives aux vecteurs viraux, voir Chung et al. 2006.

Documents complémentaires

Documents cités

  • Chung S-M, Vaidya M. and Tzfira T. (2006) Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in Plant Science 11(1), 1-4
  • Lee L-Y and Gelvin S.B. (2008) T-DNA Binary Vectors and Systems. Plant Physiology 146(2): 325-332